罗凌飞组以单细胞分辨率绘制可视化斑马鱼前肠内胚层全细胞命运图谱以解析细胞周期与胰腺命运的联系

在多细胞生物胚胎发育过程中，一个前体细胞最终可以产生一种或多种类型的成熟功能细胞。明确原始胚层中每一个前体细胞产生的所有子代细胞类型及其发育路径和轨迹，以单细胞分辨率洞悉细胞从原始胚层到各个组织器官发育成熟的“来龙去脉”，一直是发育生物学的基本问题和长期以来的研究目标，也是进一步深入理解细胞命运决定和分化机制的基础，对于功能细胞体外分化和器官再生研究具有重要指导意义。近年来，虽然以“人工DNA条形码”为代表的谱系示踪技术取得了长足发展，但仍然难以在活体胚胎中实现任一单细胞标记及长时程可视化谱系示踪，以追踪被标记细胞所产生的所有子代细胞的最终命运。因此，目前以单细胞分辨率完成脊椎动物早期胚胎单个胚层乃至整个胚胎的全细胞（即所有细胞）命运图谱存在技术障碍，阻碍了从单细胞水平深入理解细胞命运决定和分化机制。

2021年6月14日，西南大学罗凌飞课题组在PNAS在线发表了题为A single-cell-resolution fate map of endoderm reveals demarcation of pancreatic progenitors by cell cycle的研究论文，通过在斑马鱼胚胎中建立无偏见、可视化的前肠内胚层单细胞标记和示踪技术，以单细胞分辨率绘制了原始前肠内胚层全细胞命运图谱及增殖图谱，并通过图谱揭示了细胞周期与胰腺命运之间的联系。

得益于斑马鱼胚胎原肠期结束后原始内胚层的单层细胞结构，研究人员通过从绿色到红色单细胞荧光转变技术，成功将原始内胚层中的任意单个前体细胞予以标记，随后示踪至胰腺、肝脏、肠道、肝胰管等消化器官原基完全形成的48 hpf（hours post fertilization）时期，利用被标记细胞的子代细胞会继承红色荧光，可确定被标记前体细胞产生的所有子代细胞的位置和数量（图1）。

研究人员以原肠期结束后所有216个前肠内胚层前体细胞以及前端和后端部分细胞共273个内胚层前体细胞为标记和示踪对象，对每个前体细胞开展至少5次独立的单细胞标记和示踪实验，进而构建了原始前肠内胚层单细胞分辨率全细胞命运图谱（图2），明确了每个前体细胞所产生的子代细胞在前肠消化器官中的分布，并对胰腺、肝脏、肠道、肝胰管的前体细胞在原始前肠内胚层中的分布区域进行了精确划分。

对前肠内胚层所有前体细胞开展活体单细胞标记和示踪除了可以明确每个前体细胞的子代细胞位置外，还可以清晰地识别每个细胞在特定时间段（从原始胚层到48 hpf）所产生的子代细胞数目，由此可建立前肠内胚层单细胞分辨率全细胞增殖图谱（图3A）。根据图谱，研究人员发现，位于中轴线两侧的胰腺前体细胞增殖速度明显慢于其它消化器官前体细胞。利用细胞周期指示系统（Fucci Sensor）开展活体单细胞实时成像显示：胰腺前体细胞的平均G1期持续时间明显长于周围其它类型前体细胞（14小时 vs 6小时）（图3B），这种长G1期细胞周期特征是细胞自主性决定胰腺命运倾向的关键因素之一（在胰腺前体细胞中缩短G1期会使得细胞丢失胰腺命运，在周围其它类型前体细胞中延长G1期会使得细胞获得胰腺命运）。

这是第一张单个胚层核心区域的单细胞分辨率全细胞命运图谱，使得每一个前肠内胚层前体细胞的命运变得清晰。在各消化器官前体细胞缺乏分子标记的原肠期结束时的原始胚层中，精确界定各器官前体细胞区域是随后深入理解各类细胞命运决定的早期事件、是从单细胞水平解析细胞间相互作用调控细胞命运的基础，也使得研究人员可以在未来对任何一个前体细胞的行为和遗传特征进行深入探究。本研究也运用图谱揭示了细胞周期与胰腺命运之间的联系，从细胞周期的角度为胰腺发育提供了新见解，也为通过图谱理解消化器官前体细胞命运决定的早期事件提供了具体示例。

由于荧光蛋白降解、随细胞分裂的荧光蛋白稀释、荧光淬灭等原因，本研究中荧光转变产生的红色荧光仅能有效示踪48小时左右（从原始内胚层形成至60 hpf），无法长时程示踪至消化器官发育成熟时期。活体单细胞标记及长时程可视化谱系示踪技术还有待开发建立。

西南大学罗凌飞教授为本论文通讯作者，博士后杨昀和博士毕业生王淏为论文的共同第一作者。