斑马鱼基因敲除技术服务平台

有关技术服务咨询，请联系 潘鲁湲 博士 ([email protected])

平台服务描述

     基因敲除技术是人为地使靶基因的序列发生碱基对的增添、缺失或替换，引起的靶基因结构的改变，以达到定点修饰改造特定基因的目的。基因敲除技术是反向遗传学研究中最重要的技术工具。基因敲除斑马鱼广泛应用于遗传学、发育生物学、细胞生物学、医学、环境毒理学、水产育种学等研究领域。

     中心是我国唯一的国家级斑马鱼资源平台，拥有规模最大和规格最高的单体斑马鱼养殖系统和一支高素质的专业人才队伍，保证以最高标准、最高质量和最高效率完成相关技术服务。 

中心养殖系统

     目前，中心提供TALEN和CRISPR/cas9技术介导的斑马鱼基因敲除技术服务。如您对条件性基因敲除（conditional knockout）或者基因精细修饰感兴趣，也欢迎您与我们进行详细沟通。

1、TALEN（transcription activator-like (TAL) effector nucleases）介导的敲除服务

     植物细菌Xanthomonas sp.的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的。该技术首先需要构建针对任意特定核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位点打断目标基因DNA，进而在该位点进行DNA操作，如Knock-out、Knock-in或点突变。

     中心构建了斑马鱼原始生殖细胞（PGC）高效、特异表达的TALEN平台，相比常规的TALEN敲除平台，可更加高效地筛选获得TALEN敲除子代（特别是针对于效率较低的TALEN靶位而言）。

TALEN技术原理示意图

2、CRISPR/Cas9介导的敲除服务

     规律成簇间隔短回文重复（CRISPR）是一类广泛分布于细菌基因组中的重复结构，经转录并加工成短的crRNA(CRISPR RNA)。crRNA通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合，形成双链RNA，引导内切酶Cas蛋白（CRISPR-associated protein）在crRNA序列靶标的特定位点剪切双链DNA。根据CRISPR-Cas系统的作用原理，可利用其进行真核生物基因组改造，即在靶标DNA上实现特定位点的剪切，在剪切后的修复过程中会引入靶向DNA序列的突变。该技术中使用的gRNA（guide-RNA）是将crRNA和tracrRNA连接起来作为引导RNA，Cas9蛋白是type II CRISPR-Cas系统中的成员之一，具有HNH和RuvC-like两个核酸酶结构域，分别剪切靶标DNA的互补链和非互补链。

     中心构建了斑马鱼原始生殖细胞（PGC）高效、特异表达斑马鱼偏好密码子Cas9（zCas9）的CRISPR/Cas9敲除平台，相比常规的Cas9敲除平台，可更加高效地筛选获得Cas9敲除子代（特别是针对于效率较低的Cas9靶位而言）；同时，中心也提供双缺口（double nicking）的Cas9基因敲除服务，可以大大降低Cas9敲除的脱靶效应。

gRNA-Cas9技术原理示意图

特异、高效的斑马鱼PGC操作平台

平台服务内容和流程

     目前我们提供AB背景的基因敲除斑马鱼制备，AB是最为普遍使用的标准纯遗传背景之一，直接保证了委托方得到纯净背景的基因敲除斑马鱼。同时根据委托方的需求，我们也提供TU以及其它遗传背景的基因敲除制备。

1. 欢迎和我们就技术细节和具体需求进行讨论，双方签订技术服务合同。

2. 平台完成由双方商议确定的技术进行载体构建。包括制备TALEN序列识别模块（1周）或者合成gRNA（2-3天）。

3. 胚胎显微注射及突变检测。平台向斑马鱼胚胎中注射TALEN mRNA或者gRNA-cas9 mRNA复合物。鉴定注射的胚胎群体是否产生靶向突变，如有，将P0代突变斑马鱼培养至性成熟（3月）。

4. 筛选出能传递目的基因敲除的P0代斑马鱼，与野生型斑马鱼杂交（或同一基因型P0代自交），建立F1代（5天）。

5. 将F1代突变斑马鱼培养至2月龄（能够剪尾鳍进行逐尾鉴定），鉴定目的基因成功敲除的F1代并刻画敲除的基因型，交付委托方（2个月）。

服务承诺

   中心承诺在签订协议后140个工作日内，针对每个靶基因提供至少成功研制敲除品系  ≥2  尾PCR鉴定阳性的F1代斑马鱼（每个移码框突变阳性斑马鱼≥1 尾）和相应的侧交F2代胚胎（≥100枚）。

典型的突变测序峰图