贾顺姬/李栋团队合作揭示高尔基体来源小泡调控内吞体分裂

2021年6月28日，清华大学生命学院贾顺姬副研究员（孟安明教授团队）联合中科院生物物理所李栋研究员实验室在Nature Cell Biology上发文题为A Golgi-derived vesicle potentiates PtdIns4P to PtdIns3P conversion for endosome fission，揭开了高尔基体分泌小泡通过促进磷脂酰肌醇转换介导内吞体分裂的具体分子机制，证明了不同膜系统之间的高度协同互作。

磷脂酰肌醇转移蛋白（Phosphoinositide transfer proteins，PITPs）是进化上的一组古老的超家族蛋白，与细胞内信号转导以及膜转运过程相关，但目前其运转的分子机制尚不清楚。与经典的PITPs不同，SEC14类似蛋白（SEC14-like）组成了一个非典型的亚家族，可以结合通过各种疏水配体发挥广泛的生理功能[4,5]。先前的研究表明，在斑马鱼中敲除zSec14l3（SEC14L2在斑马鱼中的同源蛋白）可以延缓原肠胚形成中外包（Epiboly）过程的进行，并且造成血管腔变窄[6,7]。但是SEC14类似蛋白如何调控内吞体转运磷脂酰肌醇并不清楚。

为了揭开SEC14类似蛋白在内吞体动力学调控中的作用，结合作者们实验室先前关于斑马鱼zSec14l3以及人源hSEC14L2调节VEGFR2运输的研究工作[7]，作者们提出假设认为SEC14L2可能会在内吞体动态变化过程中发挥关键作用。因为zSec14l3被认为是hSEC14L2的同源蛋白，同时COS-7细胞系中并没有内源的SEC14L3的表达。因此，作者们将目光聚集在内源SEC14L2表达或者是过表达zSec14l3在细胞系中的表现。通过高分辨率成像结合电镜观察，作者们鉴定发现了一种高尔基体来源且高表达的SEC14L2的小泡，并将该泡命名为SEC14L2囊泡。为了对该小泡的身份进行鉴定，作者们利用ARF1的化学抑制剂BFA（Brefeldin A）进行细胞处理，阻断高尔基体小泡的形成。在BFA处理后，作者们惊讶地发现，内吞体呈现变大、拉管等异常形态，该结果暗示高尔基体在内吞体分裂过程中可能发挥着关键的调控功能。

那么，高尔基体是如何参与到ER相关的内吞体分裂的呢？先前的研究表明，内质网会通过膜接触位点（Membrane contact sites，MCSs）来确定内吞体分裂的位置和时间[8]。通过STED超分辨率成像，作者们发现内源SEC14L2囊泡会与RAB5或者RAB4阳性标记的内吞体存在广泛接触。作者们确认SEC14L2囊泡会与内吞体以及内质网进行接触。进一步地，为实时观察SEC14L2囊泡、内质网和内吞体三者之间的动态互作及形态变化，作者们利用高分辨快速成像系统GI-SIM发现，SEC14L2囊泡与内质网和内吞体均存在频繁的动态互作，并且会被特异地招募至内质网所介导的内吞体分裂位点处。

进一步地，作者们希望对SEC14L2囊泡形成的三元膜接触系统如何协助内吞体分裂的分子机制进行探究。通过磷脂酰肌醇感应器的检测，作者们发现SEC14L2囊泡会促进PtdIns4P向PtdIns3P的转化。随后，作者们发现，在内吞体分裂前，SEC14L2囊泡促进内吞体中PtdIns3P的大量积累和PtdIns4P的去除，而且只有当内吞体完成了PtdIns4P向PtdIns3P的转换之后，内吞体才能实现正常的分裂过程。通过体外重构的方法，作者们证实SEC14L2蛋白，一方面可以直接结合PtdIns3P和PtdIns4P，介导它们在不同的脂质体之间转运；另一方面，可以与PI3K结合，促进其激酶活力，用于调节PtdIns3P的合成。当敲除细胞内SEC14L2蛋白后，内吞体中的PtdIns3P含量显著下调，而PtdIns4P含量则急剧上升，同时会引起内吞体分裂过程受阻，内吞体体积显著增大（图1）。通过回补实验，研究者发现，在SEC14L2敲除的细胞中，内吞体的分裂异常可以很好地被野生型SEC14L2所挽救，但不能被PtdIns3P结合缺陷型的SEC14L2（SEC14L2-M5）所拯救，该结果证明SEC14L2的磷脂酰肌醇结合能力对于SEC14L2囊泡调控内吞体的分裂是必须的。

总的来说，该工作鉴定发现了一种高尔基体衍生的小泡SEC14L2囊泡，促进PtdIns4P向PtdIns3P转化以调节内吞体的分裂。同时作者们发现SEC14L2的缺失会造成内吞体的累积，PtdIns4P的积累与PtdIns3P减少，并削弱内吞体的分裂，导致核内体体积的显著扩大。因此，作者们的工作鉴定发现了一种内质网相关的内吞体分裂过程中膜接触位点依赖的SEC14L2囊泡促进磷脂酰肌醇转化的新机制（图2）。值得一提的是，在本文投稿过程中，Science杂志也发表了一篇高尔基体来源小泡调控线粒体分裂的文章，充分证明高尔基体来源小泡对于细胞内膜器系统稳态的重要性，而关于两种小泡是否为相同属性则需进一步验证。

据悉，清华大学生命科学学院贾顺姬副研究员和中科院生物物理所李栋研究员为该论文的通讯作者。清华大学生命学院博士后龚波和生物物理所博士后郭玉婷为该论文的共同第一作者。清华大学生命学院博士生丁诗卉、蛋白质中心脂质代谢平台刘晓蕙副研究员、清华大学生命学院孟安明教授为本文的共同作者。

参考文献

1. Doherty, G. J. & McMahon, H. T. Mechanisms of endocytosis. Annual review of biochemistry 78, 857-902, doi:10.1146/annurev.biochem.78.081307.110540 (2009).

2. Kaksonen, M. & Roux, A. Mechanisms of clathrin-mediated  endocytosis. Nature reviews.Molecular cell biology 19, 313-326, doi:10.1038/nrm.2017.132 (2018). 

3. Zoncu, R. et al. A phosphoinositide switch controls the maturation and signaling properties of APPL endosomes. Cell 136, 1110-1121, doi:10.1016/j.cell.2009.01.032 (2009).

4. Merkulova, M. I. et al. A novel 45 kDa secretory protein from rat olfactory epithelium: primary structure and localisation. FEBS letters 450, 126-130, doi:10.1016/s0014-5793(99)00470-6 (1999).

5. Shibata, N. et al. Supernatant protein factor, which stimulates the conversion of squalene to lanosterol, is a cytosolic squalene transfer protein and enhances cholesterol biosynthesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 98, 2244-2249, doi:10.1073/pnas.041620398 (2001).

6. Gong, B. et al. The Sec14-like phosphatidylinositol transfer proteins Sec14l3/SEC14L2 act as GTPase proteins to mediate Wnt/Ca(2+) signaling. eLife 6, doi:10.7554/eLife.26362 (2017).

7. Gong, B. et al. Sec14l3 potentiates VEGFR2 signaling to regulate zebrafish vasculogenesis. Nature communications 10, 1606, doi:10.1038/s41467-019-09604-0 (2019).

8. Gautreau, A., Oguievetskaia, K. & Ungermann, C. Function and regulation of the endosomal fusion and fission machineries. Cold Spring Harbor perspectives in biology 6, doi:10.1101/cshperspect.a016832 (2014).