刘彦梅/秦伟组实现了无PAM限制的SpCas9变体SpG和SpRY在斑马鱼模型中的应用

2022年6月14日，华南师范大学刘彦梅研究员/秦伟研究员和广东省人民医院费继锋教授合作在Nature Communications上发表了题为“SpG and SpRY variants expand the CRISPR toolbox for genome editing in zebrafish”的研究。该研究通过纯化蛋白并结合化学修饰gRNA的方法优化了SpCas9新变体SpG和SpRY在斑马鱼基因组的应用，并生成了SpRY介导的胞嘧啶碱基编辑器SpRY-CBE4max和腺嘌呤碱基编辑器zSpRY-ABE8e，突破了PAM的限制，实现了一些以前无法触及的疾病相关遗传变异，显著提高了CRISPR-Cas在斑马鱼基因组中的靶向性。

为了扩大基因组靶向的覆盖范围，除了识别其他可能具有不同PAM需求的天然CRISPR核酸酶外，还可以通过定向进化和结构导向设计识别其他PAM序列的SpCas9变体。最近，研究者报道了结构导向设计的方法产生的SpCas9新变体SpG和SpRY及其相关的单碱基编辑器突破了PAM的序列限制，在人类细胞和植物中表现出强大的基因编辑能力[6]。然而，SpG和SpRY核酸酶及其碱基编辑器是否可以应用于斑马鱼的基因组仍不清楚。

 

目前已知许多在细胞水平上高效的CRISPR技术不能简单地移植到动物模型上。例如，CRISPR/Cas12a系统只能以核糖核蛋白（RNP）复合物的形式应用于斑马鱼[7]；xCas9和Cas9-NG在斑马鱼基因组中，即使以RNP复合物的形式，也仅展现出有限的编辑能力。

研究人员首先构建了斑马鱼密码子优化的SpG变体，通过mRNA和体外转录合成的gRNA靶向酪氨酸酶（tyr）基因，显示出胚胎白化的表型，但与SpCas9相比白化比例较低（图1a、b）。借鉴于SpCas9核糖核蛋白复合物（Cas9：gRNA核糖核蛋白，RNP）替代mRNA可以提高突变效率[8]，研究人员将原两端的SV40 NLS替换成bpNLS并纯化成SpG蛋白后，SpG RNP复合物提高了tyr位点的突变效率（图1b）。

 

为了进一步提高SpG的编辑效率，通过2'-O-methyl-3'-phosphorothioate (MS)修饰gRNA的末端以增加其稳定性[9]，结果表明，与体外转录的未修饰gRNA（IVT gRNA）相比，无论是使用mRNA还是RNP复合物，MS修饰的gRNA（EasyEdit sgRNA，EEgRNA）显着提高了SpGCas9在四个不同PAM位点的靶向效率，且蛋白质加MS修饰的gRNA效率最高（图1c）。通过注射SpG蛋白加MS修饰gRNA复合物，在rpl17-NGA PAM敲除F0胚胎和其他RP基因靶向组中观察到小头、小眼和后脑脑室扩大的表型（图 1d）。

SpRY变体在人类细胞基因组的NRN PAMs中具有有效的编辑活性，并表现出对NYN PAMs一定的编辑能力[6]。研究人员参照SpG的优化策略，测试了48个来自三个内源基因（rpl9、rpl17和 rps16）的位点，这些位点涵盖了所有 16种可能的PAM，在斑马鱼中评估了SpRY 的核酸酶活性（图2a）和PAM的偏好性（图2b）。结果表明SpRY 在斑马鱼中对 NRN 的偏好高于NYN，这与在人类细胞和植物中报道的结果一致[6, 10]。考虑到PAM灵活的SpRY可能会增加脱靶的风险，进一步分析了三个具有相对较高切割活性的位点的脱靶效应，但并没发现起具有明显的脱靶效应（图2c）。

胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(ABE)都可以有效地应用于斑马鱼[11]，PAM的偏好性加上特定的目标窗口限制了它们在斑马鱼中的应用。最近发现SpRY-CBE4max和SpRY-ABE在培养的细胞中具有较高的活性[6]。接着研究人员在斑马鱼中分别评估了SpRY介导的CBE和ABE的编辑活性、脱靶率和产物纯度。

 研究者构建的SpRY-CBE4max在32个靶向16个基因的不同PAM位点中，有17个位点检测到C-T的碱基替换（图3a）。在患有皮肤黑色素瘤的个体患者中报告了MITF的Glu318Lys突变[12]，研究人员利用SpRY-CBE4max也成功构建了该遗传变异相关疾病模型（图3b），注射后的胚胎显示出色素缺乏的表型（图3c），表明E255K对维持 mitfa功能的必要性。

最近报道的噬菌体辅助进化的ABE8e在人类细胞中具有强大的A-G的编辑效应[13]，研究人员据此改进了腺嘌呤碱基编辑生成斑马鱼密码子优化的zSpRY-ABE8e，并用9个内源基因测试其编辑能力、脱靶率和产物纯度。zSpRY-ABE8e 在斑马鱼的不同的PAM 位点上显示出较好的A-G编辑活性，某些位点编辑效率甚至高达96%（图4a）,其高活性编辑窗口覆盖了protospacer的第3至9位核苷酸。

i-Silence是通过使用ABE将起始密码子（ATG到GTG 或ACG）突变来达到基因突变的新策略[14]。研究者使用zSpRY-ABE8e联合i-Silence策略，在斑马鱼突变了Diamond-Blackfan 贫血相关基因tsr2[15]，导致该蛋白产生M1V 突变（图4b），从而表现出小眼、尖头和轻微心包水肿（图4d），成功地创建了一种新的DBA模型（图4c）。NGS分析发现与CBE相比，zSpRY-ABE8e产生的的indels更低，且具有很高的产物纯度。

综上，通过结合纯化的含有 bpNLS 的蛋白质和 MS 修饰的gRNA， SpG和SpRY斑马鱼基因组中可以有效地靶向几乎所有PAM 的位点。此外，SpRY-CBE4max 和 zSpRY-ABE8e 可以有效地编辑以前工具无法编辑的位点。这些新开发的基因编辑工具将促进斑马鱼模型在揭示基因功能、生理机制以及疾病发病机制和治疗中的应用。

华南师范大学梁芳副研究员为论文第一作者，华南师范大学脑科学与康复医学研究院秦伟研究员和刘彦梅研究员为本论文的共同通讯作者。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、广东省重点领域研究发展计划及广东省水产经济动物病原生物学与流行病学重点实验室研究基金的支持。

参考文献
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3. Nishimasu H, Shi X, Ishiguro S, et al. Engineered crispr-cas9 nuclease with expanded targeting space. Science, 2018, 361: 1259-1262
4. Endo M, Mikami M, Endo A, et al. Genome editing in plants by engineered crispr-cas9 recognizing ng pam. Nat Plants, 2019, 5: 14-17
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6. Walton RT, Christie KA, Whittaker MN, et al. Unconstrained genome targeting with near-pamless engineered crispr-cas9 variants. Science, 2020, 368: 290-296
7. Moreno-Mateos MA, Fernandez JP, Rouet R, et al. Crispr-cpf1 mediates efficient homology-directed repair and temperature-controlled genome editing. Nat Commun, 2017, 8: 2024
8. Burger A, Lindsay H, Felker A, et al. Maximizing mutagenesis with solubilized crispr-cas9 ribonucleoprotein complexes. Development, 2016, 143: 2025-2037
9. Hendel A, Bak RO, Clark JT, et al. Chemically modified guide rnas enhance crispr-cas genome editing in human primary cells. Nat Biotechnol, 2015, 33: 985-989
10. Li J, Xu R, Qin R, et al. Genome editing mediated by spcas9 variants with broad non-canonical pam compatibility in plants. Mol Plant, 2021, 14: 352-360
11. Zhang Y, Qin W, Lu X, et al. Programmable base editing of zebrafish genome using a modified crispr-cas9 system. Nat Commun, 2017, 8: 118
12. Yokoyama S, Woods SL, Boyle GM, et al. A novel recurrent mutation in mitf predisposes to familial and sporadic melanoma. Nature, 2011, 480: 99-103
13. Richter MF, Zhao KT, Eton E, et al. Phage-assisted evolution of an adenine base editor with improved cas domain compatibility and activity. Nat Biotechnol, 2020, 38: 883-891
14. Wang X, Liu Z, Li G, et al. Efficient gene silencing by adenine base editor-mediated start codon mutation. Mol Ther, 2020, 28: 431-440
15. D'Allard DL, Liu JM. Toward rna repair of diamond blackfan anemia hematopoietic stem cells. Hum Gene Ther, 2016, 27: 792-801