当前位置：首页 > 详细信息 复旦大学彭刚组发现耳聋基因Minar2调控听觉毛细胞中胆固醇的分布与稳态
作者：CZRC 发布时间：2022/11/8 9:00:00
耳聋是最常见的感官障碍疾病[1]。目前已鉴定出120多种基因突变会引发非综合征耳聋，这反映了脊椎动物听觉系统发育和生理的复杂性。在小鼠和斑马鱼中的大规模筛选研究发现了数百个耳聋相关基因，其中部分基因的功能尚未有任何报导，提示某些关键的听觉系统发育与生理机制仍有待揭示。毛细胞作为听觉和前庭系统的机械感受器，对听觉系统至关重要[2-4]。Kiaa1024L/Minar2是一个仅在脊椎动物中保守存在的基因，它编码一个尚无任何已知功能结构域的蛋白。早前大规模筛选研究结果显示Minar2基因敲除小鼠有严重的耳聋表型[5-6]，而Minar2基因在听力方面的功能研究仍属空白。
2022年11月1日，复旦大学彭刚组在eLife杂志在线发表了题为“Kiaa1024L/Minar2 is essential for hearing by regulating cholesterol distribution in hair bundles”的研究论文。该研究利用斑马鱼作为动物模型，发现胆固醇在听觉毛细胞的纤毛束中富集，并揭示了Minar2在听觉毛细胞中调节胆固醇的运输及稳态，从而保证正常的听力。值得注意的是，在此项研究论文评审期间，Bademci等在PNAS杂志报导了在多个人类非综合征耳聋家系中检测出MINAR2基因的功能缺失突变，说明MINAR2基因在人类听力发育与生理中的重要作用[7]。
在本论文前期研究中，结合已有人、小鼠和斑马鱼的数据库分析和原位杂交实验确定了minar2在斑马鱼内耳毛细胞和侧线系统毛细胞处特异性表达。接下来研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了minar2基因敲除的斑马鱼，并通过C-start行为学和记录听觉诱发电位实验（类似人类听力脑干反应）发现minar2-/-突变幼鱼听力异常，进一步验证了minar2在脊椎动物听力功能中发挥重要作用。由于Minar2在毛细胞处特异性表达，研究人员继而检测了毛细胞的机械敏感特性和毛细胞的基础发育。实验结果显示毛细胞的形态和功能均出现异常，包括毛细胞数量显著减少、机械电转通道异常、静纤毛细长和纤毛束异常分散（图1）。
图1 minar2基因对斑马鱼的听力至关重要
图1 minar2基因对斑马鱼的听力至关重要
研究人员接下来利用Tol2转座酶系统和毛细胞特异myo6b启动子，构建毛细胞特异性表达的转基因斑马鱼。首先利用Tg(myo6b:GFP-Minar2)和Tg(myo6b:GFP-P2A-FLAG-Minar2)转基因鱼，观察到Minar2蛋白在毛细胞的顶端区域和静纤毛上定位（图2）。文献中电镜及免疫组化结果显示毛细胞顶端区域富集细胞内膜系统，其中也包括溶酶体[8-10]。利用myo6b:Lamp1-GFP特异性标记斑马鱼毛细胞中的溶酶体，实验结果显示Minar2与Lamp1的荧光信号在毛细胞顶端部分重叠，且在minar2-/-斑马鱼中溶酶体形态异常增大、变圆。这些结果均提示minar2基因的缺失导致毛细胞中溶酶体异常。
图2 Minar2的蛋白定位
图2 Minar2的蛋白定位
另一方面，研究通过生物信息学的方式检索有关Minar2分子功能的线索，发现Minar2蛋白上可能存在一个与caveolin scaffolding domain (CSD)结构域类似的序列，此CSD结构域可与胆固醇分子直接相互作用。这为深入探究Minar2在毛细胞中的机制提供了线索。产气荚膜梭状芽孢杆菌（Perfringolysin O，PFO）毒素可以结合胆固醇，D4H是一种对重组后的PFO毒素第四个结构域进行改进的生物探针，改进后可更敏感地识别胆固醇[11-15]。研究利用胆固醇探针D4H，构建了毛细胞特异Tg(myo6b:D4H-mCherry)转基因动物，首次在动物模型中实现对体内毛细胞胆固醇的标记（图3）。非常显著的是，D4H探针标记的胆固醇信号在毛细胞静纤毛和动纤毛上富集，而在毛细胞基底膜和胞体中几乎不分布。
图3 毛细胞中胆固醇和Minar2的共定位
图3 毛细胞中胆固醇和Minar2的共定位
由于Minar2蛋白和胆固醇探针D4H均分布在静纤毛上，提示Minar2与胆固醇密切相关。研究进一步发现在minar2-/-斑马鱼中发现胆固醇水平显著降低，并且使用特异性药物降低胆固醇会加重minar2-/-斑马鱼毛细胞的异常；反之使用胆固醇复合物和药物干预补加胆固醇可以拯救minar2-/-斑马鱼中毛细胞以及听力的异常。最后利用Alphafold2数据库[16]中MINAR2蛋白结构预测的结果，并与胆固醇开展分子对接，研究发现MINAR2与胆固醇分子可以通过特定的氨基酸位点互作，且这些氨基酸位点集中在分析比对得到的CSD保守区段（图4）。综上提示MINAR2通过特定的氨基酸序列结合胆固醇。
图4 MINAR2结构模型与胆固醇之间的分子对接
图4 MINAR2结构模型与胆固醇之间的分子对接
至此，研究人员得到了如下的工作模型（图5）：Minar2通过结合胆固醇，并参与胆固醇向纤毛束的转输，从而调节胆固醇在毛细胞中的稳态，进而保证毛细胞的正常发育。当minar2基因缺失后，胆固醇不能被运输至纤毛束，进而导致毛细胞纤毛束异常，伴随毛细胞顶端溶酶体异常，以及毛细胞的死亡。
图5 工作模型
图5 工作模型
综上所述，本论文发现胆固醇在听觉毛细胞的纤毛束中富集并发挥关键作用，而脊椎动物所特有的Minar2基因通过调控胆固醇的运输及稳态从而保证正常的听力。论文结果还提示通过干预毛细胞中胆固醇有望恢复人类中携带MINAR2基因突变耳聋病人的听力。此外，近期的一项筛选研究发现Minar2基因家族另一成员KIAA1024/MINAR1/UBTOR在新冠病毒SARS-Co-V2的复制中是必需的宿主因子[17]。结合课题组之前对KIAA1024/MINAR1/UBTOR的研究[18]，本论文结果提示胆固醇分子、以及在细胞内特定亚细胞器有可能成为抑制SARS-Co-V2在胞内复制的新靶点。
论文第一作者为复旦大学脑科学研究院博士研究生高鸽；通讯作者是复旦大学脑科学研究院彭刚研究员。该研究得到了国家重点研发计划和国家自然科学基金等项目的支持。
参考文献
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