澳门大学葛伟团队揭示双酚A干扰斑马鱼耳石发育的非雌激素作用机制

澳门大学健康科学学院葛伟教授团队长期利用斑马鱼模型从事鱼类生殖生理和内分泌学研究，包括环境内分泌干扰物的作用及其机理，尤其是将基因编辑技术用于环境科学研究。近年来，葛伟教授团队先后利用TALEN和CRISPR/Cas9技术构建了斑马鱼合成雌激素的芳香化酶（cyp19a1a）和雌激素核受体（esr1, esr2a, esr2b）敲除系统平台[1, 2]，并首次从遗传学角度证实了当内源雌激素消失后（cyp19a1a^-/-），BPA可以通过结合Esr2a模拟雌激素功能，从而诱导斑马鱼的卵巢分化[3]。

2023年9月，葛伟教授团队在Environmental Science & Technology杂志发表文章"Genetic and Epigenetic Evidence for Nonestrogenic Disruption of Otolith Development by Bisphenol A in Zebrafish"，以斑马鱼雌激素核受体（esr1, esr2a, esr2b）和膜受体（gper1）敲除系为研究模型，揭示了BPA在斑马鱼内耳发育中的非雌激素作用及其表观遗传作用机制。

本文首先通过一系列浓度、时间梯度实验和行为学分析，确定了在斑马鱼早期发育中BPA暴露能引起耳石发育和行为异常，并具有长期效应（图1）。作者进一步利用CRISPR/Cas9技术构建的斑马鱼雌激素核受体和膜受体四敲系（esr1^-/-; esr2a^-/-; esr2b^-/-; gper1^-/-）的不同组合，包括所有可能的双敲除、三敲除和四敲除，结合药理学分析，发现不同的敲除系均不能挽救BPA引起的耳石发育异常，同时雌二醇（estradiol, E2）和雌激素相关受体激动剂均不能模拟BPA诱导出耳石异常表型。这些遗传学和药理学实验表明， BPA并非通过雌激素信号通路而影响斑马鱼耳石发育。

那么BPA是如何引起耳石发育异常的？为了探究BPA影响耳石形成的非雌激素信号通路分子机制，作者在关键的时间点和浓度对BPA处理的斑马鱼胚胎进行了转录组分析。在众多下调的差异表达基因中，有两个基因(otopetrin 1，otop1和starmaker，stm)的显著下调引起了作者的注意，因为它们都与内耳形成有关。作者利用荧光定量PCR和整胚原位杂交验证了转录组分析结果（图2）。

研究人员接着利用CRISPR/Cas9技术，敲除了斑马鱼otop1和stm基因。结果发现，otop1的纯合突变体表现出了无耳石表型，而stm的纯合突变体出现了与BPA处理类似的粗糙的耳石，利用显微注射技术，在暴露于BPA的斑马鱼受精卵中注射otop1和stm的mRNA，结果显示两种mRNA均能挽救BPA引起的斑马鱼耳石发育异常（图3）。

为了探究BPA是如何抑制两个耳石发育关键基因的表达，作者进行了一系列的表观遗传学分析。实验结果显示，BPA并非通过影响otop1和stm启动子区域DNA甲基化，而是通过非雌激素信号，激活MEK/ERK-EZH2信号通路，从而调节otop1和stm启动子区域的组蛋白H3K27me3的富集量，进而抑制了otop1和stm的基因表达。利用MEK和EZH2抑制剂均能部分挽救BPA引起的斑马鱼耳石异常（图4）。

通过以上的系列实验，作者提供了全面的遗传和分子证据，证明BPA诱导的斑马鱼耳石发育异常不是通过干扰雌激素信号，而是通过非雌激素受体信号通路激活MEK/ERK-EZH2-H3K27me3信号通路，从而抑制otop1和stm的基因表达（图5）。该研究还表明，斑马鱼作为最常用的生物模型之一，是研究环境污染物及其分子作用机制的良好体内模型。

本文第一作者为澳门大学葛伟教授团队博士后袁明哲，于近期加入宁波大学海洋学院海水鱼育种与增养殖研究团队。澳门大学健康科学学院葛伟教授为通讯作者。该项研究得到了澳门大学、澳门科学技术发展基金、以及国家自然科学基金-澳门科学技术基金联合项目的支持。

参考文献：