云南大学陈大华团队在颅面软骨发育调控的分子机制研究取得新进展

2024年2月29日，云南大学陈大华教授团队及其合作者在Cell Press旗下知名学术期刊Cell Reports 在线发表了题为“The TET-Sall4-BMP regulatory axis controls craniofacial cartilage development”的研究论文，发现TET家族蛋白（TET2、TET3）和转录因子Sall4发生共同相分离形成凝聚体，调控BMP信号通路活性，从而影响外胚层间充质细胞向软骨细胞的分化。TET-Sall4-BMP调控轴在胚胎发育的颅面软骨发生中发挥关键功能。

研究人员以斑马鱼为动物模型，分别构建了TET家族成员TET1/TET2/TET3的单突变体以及3种双纯合突变体。结合突变体以及morpholino介导的基因敲降实验进行表型分析，发现同时缺失TET2/3会导致明显的下颌软骨发育畸形。基于普通转录组测序以及单细胞转录组测序数据的分析表明，TET2/3缺失不仅引起了剧烈的基因表达变化，更严重影响了斑马鱼胚胎中的细胞谱系发育。以显著受干扰的软骨发生过程为例：外胚层间充质细胞（Ectomesenchymal cells，EMCs）来源于神经嵴细胞，部分外胚层间充质细胞将进一步分化为软骨细胞；拟时序分析显示TET2/3缺失导致这一过程受到阻遏无法正常进行。EMC的谱系发育受到包括Wnt，FGF，BMP等在内的多个信号通路调控，而当TET2/3缺失后，BMP通路相关组分的表达受影响更为显著。遗传学证据表明，过表达Bmp4或Smad1CA均可明显回复因TET2/3缺失导致的下颌软骨畸形。以上结果证明TET2/3通过影响BMP信号通路活性来控制软骨细胞分化。

接下来，研究者利用hMeDIP-seq，BS/ox-BS-seq等技术构建了斑马鱼胚胎精细的全基因组5hmC分布图谱。相较于野生型样本，当TET2/3敲降后导致Bmp4启动子特定区域的5hmC peak消失。通过分析序列的motif特征然后进行DNA探针pull-down靶蛋白质谱鉴定技术，推测转录因子Sall4可能是调控Bmp4表达的关键蛋白。基于原位杂交以及表型分析的证据显示Sall4表达模式与Bmp4高度类似，Sall4缺失会导致下颌软骨畸形以及Bmp4表达显著下调，过表达Bmp4则可以明显恢复因Sall4缺失导致的表型。由此推断Sall4也可能通过Bmp4参与调控下颌软骨发育。此外，Sall4偏好性结合5mC/5hmC修饰的DNA分子，意味着Sall4与TET介导的5mC/5hmC转化过程存在关联。

为阐明更深入的分子机制，研究者通过ddFP系统结合活细胞显微成像实验观察到Sall4不仅自身可以凝聚形成小颗粒，当DNA分子存在时，Sall4还能快速发生相变形成更大的颗粒。有意思的是，TET2或TET3自身难以聚集，而Sall4的存在会分别促进Sall4-TET2和Sall4-TET3发生共同相分离形成大的凝聚体，并且Sall4蛋白的ZFC1结构域对共同相分离的发生起关键作用。通过这一过程，TET-Sall4共同调控Bmp4表达。综上，该研究揭示了TET-Sall4-BMP调控轴控制颅面软骨发育的详细分子机制，对于理解CFM的发病机制和诊断筛查具有重要意义。

云南大学博士研究生王伟刚、杨娜、王亮亮为论文的并列第一作者，云南大学陈大华教授、章文信副教授、华南理工大学王强教授、昆明医科大学附属口腔医院王卫红教授为论文的共同通讯作者。本工作得到国家自然科学基金基础科学中心项目的资助。