张文清/刘伟团队揭示Rb1在神经细胞增殖中的空间特异性作用和分子机制

RB1作为口袋蛋白家族的一员，通过其口袋结构域的不同区域与多种蛋白质（如E2F家族、染色质重塑物和组蛋白修饰酶）相互作用，调节多种细胞命运和细胞过程。通过建立RB1敲除小鼠，研究人员首次观察到神经细胞异位增殖和脑水肿。之后，对不同类型的神经元如神经祖细胞（NPC）、小脑祖细胞和神经胶质细胞进行RB1条件敲除，也观察到了相关神经元的过度增殖。因此，先前的研究表明RB1参与了神经细胞的增殖，但是RB1在调节脑形态中的确切作用尚存在争议。小鼠中RB1 C末端截短表现出脑减小，而NPC条件敲除RB1表现脑增大并且重量增加。目前尚不清楚Rb1是否影响脑形态发生。此外，Rb1调控神经细胞增殖和脑形态发生的潜在机制仍有待揭示。

2024年4月1日，华南理工大学医学院张文清/刘伟团队在学术期刊Journal of Genetics and Genomics上发表了题为“A role for Retinoblastoma 1 in hindbrain morphogenesis by regulating GBX family”的文章，该研究揭示了视网膜母细胞瘤蛋白（Rb1）在神经细胞增殖中的空间特异性作用和分子机制，为研究大脑不同区域神经元的差异增殖提供了新的思路。

为了阐明RB1在脑形态发生中的功能，研究团队首先利用CRISPR/Cas9和TALEN技术分别在小鼠和斑马鱼中构建了Rb1突变体（图1A和D）。研究发现小鼠Rb1突变体胚胎在E14.5全部死亡，而斑马鱼rb1突变体可以存活到12 dpf以上（图2B和E，斑马鱼脑发育阶段2 - 3 dpf与相当小鼠E12.5 - E13.5），并且均呈现后脑增大的表型（图1C和F）。为了确认后脑增大的原因，研究人员进行了增殖实验，发现后脑增大主要是由于后脑中神经细胞增殖增加引起的（图1G）。

为了确定RB1在后脑中的空间特异性作用，研究人员通过原位杂交（WISH）检测了rb1在斑马鱼中的时空表达。结果显示，rb1基因在24 hpf之前在HMVM中高表达，然后逐渐在MHB表达（图2A）。据报道，MHB和HMVM区域中的各种转录因子和信号分子在调节后脑形态发生和神经发生中起着至关重要的作用。因此，研究人员使用WISH检测了关键转录因子（fgf8a、wnt1、otx2a、otx2b、gbx1和gbx2）在这些区域中的表达。有趣的是，与sibling相比，rb1突变体中只有gbx1和gbx2的表达明显增加（图2B和C）。为了进一步分析rb1表达与gbx1/gbx2之间的关系，研究人员检测了gbx1和gbx2的时空表达模式。结果显示，与rb1相比，在24 hpf之前gbx2在MHB中高表达，随后MHB中的表达下降，HMVM和其他后脑神经元中的表达增加（图3A）。类似地，在24 hpf之前，gbx1在MHB和HMVM区域均表现出高表达水平，随后MHB下降，HMVM和其他后脑神经元表达增加（图2A）。

为了进一步鉴定神经发育后期，后脑中表达gbx1和gbx2的神经元类型，研究人员分析了8 dpf斑马鱼的全脑单细胞测序数据。结果显示，在后脑中，gbx1主要在放射状神经胶质细胞中表达（图3A），而gbx2主要在甘氨酸能、GABA能和谷氨酸能神经元中表达（图3B）。因此，研究人员进行了共定位分析，发现gbx1的表达主要在后脑运动神经元和Olig²⁺NPC中观察到。gbx2则在后脑部分甘氨酸能神经元和一些未知神经元中表达（图3C和3D）。这些发现表明，在神经发育后期，gbx1和gbx2标记了不同的后脑神经元。

据报道，前神经板中gbx1的异位表达可以扩大后脑，敲低gbx2可以减少细胞增殖。研究人员推测Rb1可能通过抑制gbx1和gbx2的表达来控制后脑神经元的增殖。为了验证这一推测，研究人员将gbx1或gbx2的吗啉代修饰的反义寡核苷酸（MO）注入rb1突变体来敲低gbx1或gbx2的表达。结果显示，降低gbx1和gbx2的表达能够部分拯救rb1突变体的后脑扩张（图4A和B）。然后，研究人员通过BrdU染色研究了gbx1和gbx2减少对后脑神经元增殖的影响。结果表明，降低gbx1和gbx2的表达能够部分拯救rb1突变体后脑神经细胞增殖（图4C和D）。上述数据表明，Rb1通过抑制gbx1和gbx2的表达而参与后脑形态发生和神经细胞增殖。

Rb1对细胞周期激活基因表达的调节通常通过其口袋结构域与转录调控蛋白（如E2Fs）的结合/释放作用来实现。为了阐明Rb1的哪些结合蛋白参与Rb1调节gbx1和gbx2的表达，研究人员分析了已报道的ChIP序列数据并筛选出Rb1的结合蛋白。研究人员分析发现Rb1结合蛋白E2f1、E2f3、Hdac1和Dnmt1可以结合gbx1启动子，而E2f1h和Hdac1可以结合gbx2启动子。为了验证这一结果，研究人员使用MO分别敲低e2f1、e2f3、hdac1和dnmt1，并检测了rb1突变体后脑中gbx1/gbx2表达。结果表明，只有敲低e2f3和hdac1的才能部分挽救rb1突变体后脑增大，并且显著降低gbx1和gbx2的表达（图5A-D）。此外，注射斑马鱼rb1 (zrb1) mRNA可以显著降低gbx2的表达（图5E），而zrb1^△4aamRNA（RB1与Hdac1结合的四个氨基酸发生突变）不能挽救gbx2的表达（图6E）。上述数据表明，Rb1通过结合E2f3和Hdac1分别抑制gbx1和gbx2的表达来调节后脑形态发生和神经细胞增殖。

研究者认为这一发现揭示了RB1通过调控E2f3-Gbx1轴和Hdac1-Gbx2轴在后脑神经细胞增殖和形态发生中的具体作用，为探索不同脑区神经元的差异增殖提供了新的思路。

华南理工大学医学院赵爽博士和王晨硕士并列本文的第一作者，张文清教授，刘伟副教授并列通讯作者。华南理工大学医学院为第一作者单位。本课题受到国家重点研发（2018YFA0801000）、广东省基础与应用基础研究基金（2023A1515010396）和广州市科技计划（202201010156）项目资助。